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一、實(shí)驗(yàn)前準(zhǔn)備工作:
1、培育瓶的包被:包被液如多聚賴氨酸或纖維粘連蛋白,以無菌水稀釋至2 ug/cm2的濃度包被培育瓶。37度孵箱1小時(shí)或4度過夜,從包被好的培育瓶中收回多聚賴氨酸,并用無菌水洗刷培育瓶2遍。包被好的培育瓶不要放置超過24小時(shí),其中的包被液可吸出重復(fù)使用2-3次,留意不要污染。
2、*培育基的配置:以內(nèi)皮細(xì)胞培育基為例,把配套的胎牛血清、生長因子和雙抗參加根底培育液中。重新貼好標(biāo)簽,并混勻培育基。
二、原代細(xì)胞復(fù)蘇辦法:
1、從液氮中取出原代細(xì)胞冷凍管,迅速投入37~38 ℃水浴中,其間能夠悄悄滾動(dòng)細(xì)胞,加速消融速度,大約需求1分鐘時(shí)刻。
2、5分鐘內(nèi)用培育基稀釋至原體積的10倍以上,參加培育瓶中,再用1ml培育基洗刷細(xì)胞凍存管,確保細(xì)胞都被參加培育瓶中,靜置于孵箱,12-16小時(shí)后替換培育基(除去DMSO)。今后每2天換一次液,確保細(xì)胞狀況杰出。
三、原代細(xì)胞傳dai辦法:酶消化法
當(dāng)細(xì)胞生長至70-80%左右能夠傳代,傳代份額以1:2或1:3為佳。具體辦法如下:
1、棄去培育瓶中培育基,用PBS洗刷培育瓶2遍,參加0.25%的胰酶消化液,以消化液能覆蓋整個(gè)瓶底為準(zhǔn)。37度孵育4分鐘左右,輕拍培育瓶旁邊面,顯微鏡下觀察細(xì)胞消化狀況,直到80%細(xì)胞呈現(xiàn)圓形。
2、細(xì)胞消化好后,參加胰酶中和液,并悄悄搖擺培育瓶,形成細(xì)胞懸液,然后將細(xì)胞和培育基轉(zhuǎn)移至離心管中,1000rpm離心5分鐘。
3、棄去上清液,以1-2ml新鮮培育基重新懸浮細(xì)胞并吹打均勻,接種于包被好的新培育瓶中,瓶中已有10ml左右的培育基,放入培育箱中培育,每2天替換培育基。