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    口蹄疫酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)

    發(fā)布時間: 2011-11-07  點擊次數(shù): 1878次

    口蹄疫酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)

    1979年Crowther建立了間接夾心ELISA,ELISA試驗是當(dāng)前應(yīng)用zui廣的一種免疫測定方法,它是以物理方法將抗體(或抗原)吸附在固相載體上,隨后的一系列免疫學(xué)反應(yīng)和生物化學(xué)反應(yīng)都在此固相載體上進(jìn)行的免疫酶測定試驗,包括間接法、雙抗體夾心法和競爭法以及近年來發(fā)展的一些改良法。1989年被歐洲FMD防制委員會推薦廣泛使用,成為認(rèn)可的一種標(biāo)準(zhǔn)化診斷技術(shù)。

    近年來,ELISA已先后用于FMD病原和血清樣品的診斷并逐步代替補體結(jié)合試驗以及中和試驗。這項技術(shù)快速、敏感、準(zhǔn)確,用滅活的140S制備抗血清或作抗原,可在一般的實驗室操作,還可制成方便的診斷試劑盒。檢測田間樣品時ELISA的敏感性高于補體結(jié)合試驗;對于含量較高的樣品,例如新鮮的水皰皮和細(xì)胞培養(yǎng)物,可在2—4h內(nèi)獲得結(jié)果,應(yīng)用預(yù)先在實驗室內(nèi)包被的免疫反應(yīng)板以及凍干劑,將更便于現(xiàn)場檢測。

    2004年G.丸Paiba等應(yīng)用固相競爭ELISA(SPCE)對綿羊、山羊和豬分別進(jìn)行了O型FMD血清學(xué)抗體檢測,并對效果進(jìn)行了比較。試驗對2001年英國暴發(fā)FMD其間的267頭綿羊和143頭豬分別進(jìn)行VNT和SPCE檢測,發(fā)現(xiàn)SPCE較VNT能夠檢測出更多的陽性結(jié)果。2001年英國FMD暴發(fā)期間大規(guī)模的血清學(xué)調(diào)查已充分證實了SPCE方法的靈敏性、可施行性和可重復(fù)性。同時田間血清學(xué)試驗和實驗室血清學(xué)實驗也同樣表明與VNT相比,SPCE方法的敏感性很少因病毒毒株的不同而受影響。

    以ELISA為基礎(chǔ)的檢測方法,有許多客觀的*性,敏感性相對較高且適合于大規(guī)模的血清學(xué)調(diào)查,F(xiàn)MDV非結(jié)構(gòu)蛋白特異性抗體會存在于FMDV持續(xù)感染、短期感染、間歇性感染的豬體,因此FMDV非結(jié)構(gòu)蛋抗體檢測試劑盒已經(jīng)被研制。我國中國臺灣省已經(jīng)開始使用NSP抗體檢測ELISA試劑盒。ELISA同時也存在著弊端,2004年Fan Lee等對三種FMDV非結(jié)構(gòu)蛋抗體檢測試劑盒(CHEKIT FMD—3ABC、UBI FMD NS EIA和DVIVRNSPELISA)檢測效果進(jìn)行了對比研究。這些FMDV非結(jié)構(gòu)蛋白抗體檢測試劑盒被分別應(yīng)用于健康豬、感染豬和疫苗免疫過的豬,并對試劑盒的特異性與靈敏度進(jìn)行了檢測。表明特定的三種FMDV非結(jié)構(gòu)蛋白抗體檢測試劑盒都很難將感染病畜與已康復(fù)牲畜區(qū)分開,這給檢測工作帶來了較大的困難。

    ①間接夾心ELISA。間接夾心ELISA是目前OIE FAO(聯(lián)合國糧農(nóng)組織)的FMD—WRI。(世界參考實驗室)確認(rèn)的檢測FMDV抗原和病毒血清型的方法。該法采用典型的雙抗夾心ELISA操作方式,在ELISA多孔板的不同排部分用型特異兔抗FMD病毒幾個血清型的抗血清(捕獲抗體)包被,于各孔加入被檢樣品懸液,并設(shè)強陽性、弱陽性、陰性和空白對照,再加每個FMDV型特異的豚鼠抗血清(檢測抗體),隨后,加酶標(biāo)記的羊抗豚鼠血清(交聯(lián)劑)。每一步都應(yīng)充分洗滌未結(jié)合的試劑。加酶底物后,出現(xiàn)顏色反應(yīng)時可判為陽性反應(yīng),強陽性反應(yīng)時,肉眼即可判定。也可用酶標(biāo)讀板儀在適當(dāng)?shù)牟ㄩL內(nèi)讀取結(jié)果,在這種情況下,光吸收值比背景大o.1以上即可判為陽性反應(yīng),可定出相應(yīng)的血清型。光吸收值接近o.1時,應(yīng)重復(fù)做或用組織培養(yǎng)物傳代擴(kuò)增抗原,當(dāng)出現(xiàn)CPE時,檢測上清液。間接夾心ELISA用于FMD的檢測和定型時,特異性與CFT相同,靈敏度更高,且節(jié)省試劑,重復(fù)性好,加之與連接計算機的酶標(biāo)儀可使操作自動化,判讀結(jié)果更準(zhǔn)確,在接到待檢樣品后4~5h即可出結(jié)果。對于FMD的檢測和定型及制定FMD的防治計劃,有著十分重要的意義。

    ②液相阻斷夾心ELISA。1986年Hamblin等的液相封閉ELISA(LPBE)問世,該法是將各型已知量的病毒與2倍連續(xù)稀釋的被檢血清混合37~C振蕩lh后轉(zhuǎn)入4~C濕盒作用,使之充分結(jié)合。待檢血清中若含有某型抗體,必然與同型病毒抗原結(jié)合。試驗時將上述混合液轉(zhuǎn)入已用各型相應(yīng)捕獲抗體包被好的ELISA板中,之后依次加入檢測抗體、交聯(lián)劑、底物和終止液,zui后用酶標(biāo)儀判讀結(jié)果。若有未結(jié)合的抗原,必然會與捕獲抗體結(jié)合。形成的復(fù)合物與隨后的檢測抗體作用,zui后按試驗孔呈現(xiàn)顏色與抗原對照(末加血清)孔呈現(xiàn)的顏色相比判定結(jié)果。顏色的深淺和抗體的含量呈負(fù)相關(guān),即顏色越深,被檢血清中的抗體含量越少。當(dāng)被檢樣品的OD(光學(xué)密度)值小于或等于對照抗原OD值的50%時,該樣品判定為陽性,血清抗體效價以產(chǎn)生相當(dāng)于50%抗原對照平均值的血清zui終稀釋度表示。其抗體效價1;40相當(dāng)于VNT效價1:16(VNT檢測標(biāo)準(zhǔn)是抗體效價在1:16以下為陰性)。該方法尤其適合于大批樣品的血清學(xué)調(diào)查。彌補了VNT的不足,由于VNT方法易產(chǎn)生假陽性反應(yīng),需要有一定的技能來產(chǎn)生重復(fù)性的結(jié)果,因此ELISA方法已經(jīng)被*大量的實驗室采納作為疫病監(jiān)測方法。對于FMD血清抗體的監(jiān)測具有廣闊的應(yīng)用前景。
     

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