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    ELISA試劑盒的定性和定量

    發(fā)布時間: 2015-03-27  點擊次數(shù): 908次

        ELISA檢測試劑盒的結(jié)果判定分為定性和定量兩種 ,在間接法和夾心法ELSIA中,陽性孔呈色深于陰性孔。在競爭法ELISA中則相反,陰性孔呈色深于陽性孔。那么兩類結(jié)果如何判斷呢?南京森貝伽生物技術(shù)為您解析: 
    (1)間接法和夾心法
    這類反應的定性結(jié)果可以用肉眼判斷。目視標本也無色或近于無色者判為陰性,顯色清晰者為陽性。但在ELSIA中,正常人血清反應后常可出現(xiàn)呈色的本底,此本底的深淺因試劑的組成和實驗的條件不同而異,因此實驗中必須加測陰性對照。陰性對照的組成應為不含受檢物的正常血清或類似物。在用肉眼判斷結(jié)果時,更宜用顯色深于陰性對照作為標本陽性的指標。
    目視法簡捷明了,但頗具主觀性。在條件許可下,應該用比色計測定吸光值,這樣可以得到客觀的數(shù)據(jù)。先讀出標本(sample,S)、陽性對照(P)、和陰性對照(N)的吸光值,然后進行計算。計算方法有多種,大致可分為陽性判定值法和標本與陰性對照比值法兩類。
    a.陽性判定值 
    陽性判定值(cut-off value)一般為陰性對照A值加上一個特定的常數(shù),以此作為判斷結(jié)果陽性或陰性的標準。
    用此法判斷結(jié)果要求實驗條件十分恒定,試劑的制備必須標準化,陽性和陰性的對照品應符合一定的規(guī)格,須配用精密的儀器,并嚴格按規(guī)定操作。陽性判定值公式中的常數(shù)是在這特定的系統(tǒng)中通過對大量標本的實驗檢測而得到的?,F(xiàn)舉某種檢測HBsAg的試劑盒為例。ELISA檢測試劑盒試劑盒中的陰性對照品為不含HBsAg的復鈣人血漿,陽性對照品HBsAg的含量標明為P=9±2ng/ml。每次試驗設2個陽性對照和3個陰性對照。測得A值后,先計算陰性對照A值的平均數(shù)(NCX)和陽性對照A值的平均數(shù)(PCX),兩個平均數(shù)的差(P-N)必須大于一個特定的數(shù)值(例0.400),試驗才有效。3個陰性對照A值均應≥0.5×NCX,并≤1.5×NCX,如其中之一超出此范圍,則棄去,而已另兩個陰性對照重新計算NCX;如有兩個陰性對照A值超出以上范圍,則該次實驗無效。陽性判定值按下式計算:陽性判定值=NCX+0.05,標本A值>陽性判定值的為陽性,小于陽性判定值的為陰性。應注意的是,式中0.05為該試劑盒的常數(shù),只適合于該特定條件下,而不是對各種試劑均可通用。
    根據(jù)以上敘述可以看出,在這種方法中陰性對照和陽性對照也起到試驗的質(zhì)控作用,試劑變質(zhì)和操作不當均會產(chǎn)生"試驗無效"的后果。
    b.標本/陰性對照比值 
    在實驗條件(包括試劑)較難保證恒定的情況下,ELISA試劑盒這種判斷法較為合適。在得出標本(S)和陰性對照(N)的A值后,計算S/N值。也有寫作P/N的,這里的P不代表陽性(positive),而是病人(patient)的縮寫,不應誤解。為避免混淆,更宜用S/N表示。在早期的間接法ELISA中,有些作者定出S/N為陽性標準,現(xiàn)多為各種測定所沿用。實際上每一測定系統(tǒng)應該用實驗求出各自的S/N的閾值。更應注意的是,N所代表的陰性對照是不含受檢物質(zhì)的人血清。有的試劑盒中所設陰性對照為不含蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì)含量較底的緩沖液,以致反應后產(chǎn)生的本底可能較正常人血清的本底低得多。因此,這類試劑盒規(guī),如N<0.05(或其他數(shù)值),則按0.05計算,否則將出現(xiàn)假陽性結(jié)果。
    (2)競爭法
    在競爭法ELISA中,陰性孔呈色深于陽性孔。陰性呈色的強度取決于反應中酶結(jié)合物的濃度和加入競爭抑制物的量,一般調(diào)節(jié)陰性對照的吸光度在1.0-1.5之間,此時反應zui為敏感。
    競爭法ELISA不易用自視判斷結(jié)果,因肉眼很難辨別弱陽性反應與陰性對照的顯色差異,一般均用比色計測定,讀出S、P和N的吸光值。計算方法主要也有兩種,即陽性判定值法和抑制率法。
    a. 陽性判定值法
    與間接法和夾心法中的陽性判定值法基本相同,ELISA檢測試劑盒但在計算公式中引入陽性對照A值,現(xiàn)舉某種檢測抗HBc的試劑盒為例。試劑盒中的陰性對照為不含抗HBc的復鈣人血漿,陽性對照中抗HBc含量為125±100u/ml。每次試驗設2個陽性對照和3個陰性對照。測得A值后,先計算陰性對照A值的平均值(NCX)和陽性對照A值的平均數(shù)(PCX),兩個平均數(shù)的差(N-P)必須大于一個特定的數(shù)值(例如0.300),試驗才有效。3個陰性對照A值均應小于2.000,而且應≥0.5×NCX并≤1.5×NCX,如其中之一超出此范圍,則棄去,而以另2個陰性對照重新計算×NCX;如有2個陰性對照A超出以上范圍,則該次實驗無效。陽性判定值按下式計算:陰性判定值=0.4×NCX+0.6×PCX,標本A值≤陽性判定值的反應為陽性,A>陽性判定值的反應為陰性。 
    b. 抑制率法 
    抑制率表示標本在競爭結(jié)合中標本對陰性反應顯色的抑制程度,按下式計算:
    抑制率(%)= (陰性對照A值-標本A值)×100%/陰性對照A值,一般規(guī)定抑制率≥50%為陽性,<50%為陰性。

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