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牛泰勒蟲抗體（Theileria）ELISA試劑盒使用說明書
本試劑盒僅供研究使用。
使用目的：本試劑盒用于測(cè)定牛血清、血漿及相關(guān)液體樣本中泰勒蟲病（theileriasis）的表達(dá)。

實(shí)驗(yàn)原理

本試劑盒應(yīng)用雙抗體夾心法測(cè)定標(biāo)本中牛泰勒蟲病（theileriasis）表達(dá)。用純化的牛泰勒蟲病

（theileriasis）抗體包被微孔板，制成固相抗體，可與樣品中泰勒蟲病（theileriasis）相結(jié)合，經(jīng)

洗滌除去未結(jié)合的抗原和其他成分后再與 HRP 標(biāo)記的泰勒蟲病（theileriasis）抗體結(jié)合，形成

抗體-抗原-酶標(biāo)抗體復(fù)合物，經(jīng)過*洗滌后加底物 TMB 顯色。TMB 在 HRP 酶的催化下

轉(zhuǎn)化成藍(lán)色，并在酸的作用下轉(zhuǎn)化成zui終的。用酶標(biāo)儀在 450nm 波長下測(cè)定吸光度（OD

值），與 CUTOFF 值相比較，從而判定標(biāo)本中牛泰勒蟲病（theileriasis）的存在與否。

標(biāo)本要求

1．標(biāo)本采集后盡早進(jìn)行提取，提取按相關(guān)文獻(xiàn)進(jìn)行，提取后應(yīng)盡快進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。若不能

馬上進(jìn)行試驗(yàn)，可將標(biāo)本放于-20℃保存，但應(yīng)避免反復(fù)凍融

2．不能檢測(cè)含 NaN3 的樣品，因 NaN3 抑制辣根過氧化物酶的（HRP）活性。

操作步驟

1.編號(hào)：將樣品對(duì)應(yīng)微孔按序編號(hào)，每板應(yīng)設(shè)陰性對(duì)照 2 孔、陽性對(duì)照 2 孔、空白對(duì)照 1

孔（空白對(duì)照孔不加樣品及酶標(biāo)試劑，其余各步操作相同）

2.加樣：分別在陰、陽性對(duì)照孔中加入陰性對(duì)照、陽性對(duì)照 50µl。然后在待測(cè)樣品孔先

加樣品稀釋液 40µl，然后再加待測(cè)樣品 10µl。加樣將樣品加于酶標(biāo)板孔底部，盡量不

觸及孔壁，輕輕晃動(dòng)混勻，

3.溫育：用封板膜封板后置 37℃溫育 30 分鐘。

4.配液：將 30 倍濃縮洗滌液用蒸餾水 30 倍稀釋后備用

5.洗滌：小心揭掉封板膜，棄去液體，甩干，每孔加滿洗滌液，靜置 30 秒后棄去，如此

重復(fù) 5 次，拍干。

6.加酶：每孔加入酶標(biāo)試劑 50µl，空白孔除外。

7.溫育：操作同 3。

8.洗滌：操作同 5。

9.顯色：每孔先加入顯色劑 A50µl，再加入顯色劑 B50µl，輕輕震蕩混勻，37℃避光顯色

15 分鐘.

10. 終止：每孔加終止液 50µl，終止反應(yīng)（此時(shí)藍(lán)色立轉(zhuǎn)）。

11. 測(cè)定：以空白空調(diào)零，450nm 波長依序測(cè)量各孔的吸光度（OD 值）。 測(cè)定應(yīng)在加終止

液后 15 分鐘以內(nèi)進(jìn)行。

計(jì)算和結(jié)果判定：

試驗(yàn)有效性：陽性對(duì)照孔平均值≥1.00; 陰性對(duì)照平均值≤0.10

臨界值（CUT OFF）計(jì)算：臨界值=陰性對(duì)照孔平均值+0.15

陰性判定：樣品 OD 值< 臨界值（CUT OFF）者為泰勒蟲病（theileriasis）陰性

陽性判定：樣品 OD 值≥ 臨界值（CUT OFF）者為泰勒蟲病（theileriasis）陽性

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